我们的研究提供了一种新的脱氨基酶筛选方案，为碱基编辑器的构建带来了更多选择。一方面突破了腺嘌呤碱基编辑器脱氨基酶底层专利的限制，也为差异化碱基编辑器工具开发奠定了基础。”复旦大学脑科学转化研究院程田林研究员表示。

最近，他和团队发现：20 多种新型 TadA 同源蛋白在经过简单改造之后，可被用于腺嘌呤碱基编辑器 ABE、胞嘧啶碱基编辑器 CBE 以及兼具两者功能的 ACBE 的构建。针对这 20 多种新型 TadA 同源蛋白，课题组均已申请了技术发明专利。

在应用前景上，借助这项成果可以开发更多差异化的、具有不同碱基编辑特性的碱基编辑器，从而实现遗传病的个体化精准治疗。

在疾病治疗和临床应用上，碱基编辑器必须具备高效、精准和安全等特征。从特定角度来讲，精准和安全可谓是一体两面：足够的精准，便意味着足够安全。

实际上，药物研发乃至各类治疗策略的研发，都是基于以下两个思路：一是“包治百病”的普适性疗法；二是“因人而异”的个体化精准疗法。

基因编辑乃至于碱基编辑器的开发，同样存在着这两种思路：思路之一是一种碱基编辑器“打天下”，只用根据致病位点改变 gRNA 即可；思路之二是根据不同的疾病位点，来调整碱基编辑器和 gRNA 的组合，而且最好是一种组合仅在特定的致病位点上有效。

在此次研究里，程田林团队筛选出多种脱氨基酶，也开发出多种碱基编辑器。毫无疑问，这将助力于开发差异化的碱基编辑器，进而推动个体化精准治疗的实现。

亟需能高效精准修复致病突变的基因组编辑工具

从生物学和还原论角度来讲，人体是众多细胞的有机组合体，人体健康离不开细胞的正常运转。细胞正常运转与否的根本，在于细胞内遗传物质基因组 DNA 的正确与否。

对于遗传、蛋白质编码以及生命过程来讲，DNA 和其编码的基因所提供指令是必不可少的。很多疾病特别是遗传病的根源就在于 DNA 及其编码的基因发生了突变。

因此，从遗传的角度而言，如能实现致病突变的原位精准修复，理论上将可以根治多种疾病。

基因编辑技术，是实现致病突变原位精准修复的有力武器，学界已有大量相关研究正在推进中。在基因编辑技术中，最具代表性的就是 CRISPR-Cas9 系统，这一系统给基因编辑研究带来了革命性突破，让基因编辑效率和精准度产生了质的飞跃。

不过，经典的 CRISPR-Cas9 系统依然存在缺陷：它能以极高的效率破坏 DNA 序列的完整性，但是精准修复 DNA 序列的效率却比较低。

因此，要想更好地治疗遗传疾病，亟需开发一款可以高效精准修复致病突变的基因组精准编辑工具。

2016 年以来，美国哈佛大学教授David Liu 实验室将碱基脱氨基酶与 CRISPR-Cas9 系统组合，开发出可介导单碱基点突变的新型基因组精准编辑工具——碱基编辑器（base editors）。

碱基编辑器的核心组分，分别是 Cas9 核酸酶和碱基脱氨基酶。根据碱基脱氨基酶的不同，碱基编辑器又分为胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base Editor，ABE）。

其中，CBE 中的碱基脱氨基酶是——胞嘧啶脱氨基酶，它可以介导碱基胞嘧啶 C 突变为胸腺嘧啶 T（即 C>T 突变）；

ABE 中的脱氨基酶是——腺嘌呤脱氨基酶，它可以介导碱基腺嘌呤 A 突变为鸟嘌呤 G（即 A>G 突变）。

由此可知，CBE 和 ABE 是一类基因组精准编辑的工具，可以实现基因组目标位点 C>T 或 A>G 的单碱基点突变。

可介导单碱基点突变的基因组精准编辑工具的重要价值在于，在人类的致病遗传变异中，单碱基点突变的占比接近 60%。单就 C>T 和 A>G 点突变而言，其在人类致病遗传变异中的占比也达到 35%。

这意味着在人类遗传病治疗中，CBE 和 ABE 具备非常广阔的应用前景，相关研究也一直热度不减。不过随着相关课题的推进，研究人员发现 CBE 和 ABE 在包括编辑活性、编辑窗口、序列的偏好性以及安全性在内的多个方面，依然存在一些缺陷与不足。

作为碱基编辑器的核心组分之一，对于 CBE 和 ABE 介导 C>T 和 A>G 突变的编辑活性、编辑窗口以及序列的偏好性来说，碱基脱氨基酶都会给它们带来重要影响。

以 CBE 为例，好几种胞嘧啶脱氨基酶都能用于构建功能性 CBE，比如人源 AID（activation-induced cytidine deaminase）、人源 APOBEC3A、大鼠源 APOBEC1、以及七鳃鳗源 PmCDA1、LjCDA1 等。

不同类型胞嘧啶脱氨基酶所构建的 CBE，在目标位点的编辑活性、编辑窗口以及序列偏好性各不相同。

不同种类胞嘧啶脱氨基酶所带来的独特的碱基编辑特性，有着非常重要的意义，它能帮助科学家开发出差异化的 CBE 工具，从而解决 CBE 在编辑活性、编辑窗口以及序列的偏好性等方面的不足，进而更好地解决各类致病遗传变异，在治疗更多遗传病的同时，还能实现个体化的精准治疗。

就临床应用而言，编辑活性、编辑窗口、以及序列偏好性等问题，会给可被治疗的疾病种类和数量带来一定影响，同时还会伴随致命的安全风险。如今，经典的 CRISPR-Cas9 系统已被用于临床治疗研究，不过其安全风险已经是相对可控的。

与经典的 CRISPR-Cas9 相比，CBE 和 ABE 拥有额外的脱氨基酶组分，那么这种组分是否会导致额外的安全风险？

研究发现，由于胞嘧啶脱氨基酶对于单链 DNA 具有亲和力，CBE 会导致严重的 DNA 脱靶风险，即当 CBE 位于基因组目标位点之外的区域时，会导致 DNA 发生突变。

而由于腺嘌呤脱氨基酶对 RNA 具有亲和力，所以 ABE 会带来严重的 RNA 脱靶风险，也就是 ABE 会导致 RNA 的突变。

为解决 CBE 和 ABE 的脱靶风险，学界对脱氨基酶组分进行了一系列的蛋白质工程改造研究，一定程度上解决了 CBE 和 ABE 在 DNA/RNA 水平的脱靶风险。

不过，由于 CBE 导致的 DNA 脱靶会带来永久性的基因组损伤，其安全风险尤为值得关注。

尽管针对胞嘧啶脱氨基酶的蛋白质工程化改造，在很大程度上解决了 CBE 工具 DNA 脱靶引起的安全风险，但同时也限制了 CBE 的编辑活性、编辑窗口以及序列偏好性。

鉴于胞嘧啶脱氨基酶是导致 DNA 脱靶的核心因素，曾有课题组尝试开发胞嘧啶脱氨基酶的替代品，以从根本上解决 CBE 导致的 DNA 脱靶风险。

胞嘧啶脱氨基酶替代品的发现，源自对于 ABE“副作用”的研究：研究者注意到 ABE 表现出一定的 CBE 活性，即除了介导 A>G 突变之外，在某些特定的位点上还能介导 C>T 活性。

这说明用于 ABE 构建的腺嘌呤脱氨基酶组分，或许具备被改造的可能，并有希望用于 CBE 的构建。考虑到 ABE 在 DNA 水平的高安全性，这样改造而来的 CBE 有望突破 DNA 脱靶的困扰。

多年来，程田林课题组一直致力于新型基因编辑技术的研发，尤其关注基因组精准编辑工具研究。

包括该团队在内的国内外多个实验室均已发现，通过蛋白质工程改造，可以实现腺嘌呤脱氨基酶的重编程。重编程后的腺嘌呤脱氨基酶突变体，可以构建出低 DNA 脱靶风险的 CBE。

对于 CBE 的构建来说，这也是一条新的思路。同时也意味着，腺嘌呤脱氨基酶在碱基编辑器领域有着独特且关键的地位，它不仅是构建 ABE 的关键，也是构建高安全性 CBE 的关键。

然而，目前存在的待解问题之一是：自然界中存在多种可编辑 DNA 的天然胞嘧啶脱氨基酶，它们都能被用于构建 CBE。然而，对于 ABE 来说自然界里却缺少相应的天然腺嘌呤脱氨基酶。

为此，美国哈佛大学David Liu 实验室通过蛋白定向演化策略，对大肠杆菌来源的腺嘌呤脱氨基酶 TadA（ecTadA）进行多轮改造，最终获得了可以编辑 DNA 的 ecTadA 突变体，并构建出了高活性的 ABE。

由于 ecTadA 的改造过程过于复杂，需要在 10+位点同时引入点突变才能改造成功。截止目前，依旧没有科研团队去尝试改造其它的腺嘌呤脱氨基酶。

也正因此，现有的各类 ABE 工具乃至由 ABE 重编程而来的高安全性 CBE 中的脱氨基酶组分，均为 ecTadA 突变体。

这会导致多个问题：

一是 ABE 核心组分——脱氨基酶的底层专利属于美国；

二是 ABE 核心组分脱氨基酶，都源自于大肠杆菌的 TadA 蛋白，很有可能会限制差异化 ABE 工具的研究；

三是通过腺嘌呤脱氨基酶重编程开发的高安全性 CBE，需要在前期 ecTadA 复杂改造的基础上继续进行改造，并且同样面临底层专利受限以及工具差异化研究受限的难题。

因此，对于研发碱基编辑器来说，设计新的腺嘌呤脱氨基酶改造和筛选策略，在 ABE 和 CBE 的开发中都是至关重要的。

此外，这背后还涉及到更深层的科学问题：胞嘧啶脱氨基酶 AID/APOBEC 蛋白家族和腺嘌呤脱氨基酶 TadA 蛋白家族两者之间是否存在演化关系？虽然有研究提示 AID/APOBEC 可能起源于 TadA，但是仍然缺少足够的证据支持。而 TadA 兼具构建 ABE 和 CBE 的潜力，或许能为两种脱氨基酶的演化关系提供更多证据。

构建更具特色的碱基编辑器

程田林课题组通过研究发现，与传统的末端融合相比，通过 Cas9 内部融合构建的 ABE 具有更高的活性。而且在内部融合的基础上，ecTadA 仅需经过双保守位点的简单改造，就能获得高活性的 ABE。相比传统 10+位点的同时突变，这是一个巨大的进步。

为此，他和团队通过内部融合策略，并结合双保守位点突变的蛋白质工程改造，筛选出 20 多种全新的 TadA 同源蛋白突变体，并将它们用于碱基编辑器构建。

更重要的是，这种全新的筛选策略、尤其是双保守位点突变这样一种简单的蛋白质工程改造策略，不仅可以构建 ABE、还能构建出 CBE 和 ACBE。

这种新筛选策略的意义在于，打破了腺嘌呤脱氨基酶 TadA 改造的“枷锁”，为碱基编辑器 ABE 和 CBE 的构建提供了更多可能。

从蛋白演化的角度来说，本次工作也提供了更多证据，支持了 AID/APOBEC 可能起源于 TadA 的这一假说。

程田林表示，基因编辑研究课题的开展，关键在于切入点的寻找。2019 年，他就已经注意到相比传统的末端融合，Cas9 内部融合策略构建的 ABE 活性更高。

其中，Cas9 内部的 DS1249 位点融合 ecTadA 突变体后，不仅表现出最强的 ABE 活性，还能表现出一定的 CBE 活性，相关论文已于 2020 年发表在 Nature Communications。

而考虑到 DS1249 位点融合对于碱基编辑器活性的增益效果，他和团队一直在探索是否能将 DS1249 位点融合，用于开发新型 CRISPR-Cas9 的衍生工具。

另据悉，ABE 研究的“开山之作”来自上文的 David Liu 团队，而 ecTadA 改造的核心点突变是 A106V 和 D108N 双点突变，这两点突变代表着“0 到 1 的改变”，它让 ecTadA 真正具备了编辑 DNA 的能力。

不过，仅仅凭借 A106V 和 D108N 双点突变的 ecTadA 突变体所构建的 ABE，在人源细胞中生成的 A>G 编辑活性非常低，需要经过多轮优化和更多点突变的引入之后，才能构建出高活性的 ABE 工具。

考虑到 Cas9 的 DS1249 位点融合，可以显著提升碱基器的活性。因此，程田林将内部融合策略与 ecTadA（VN）突变体互相结合，以此来探索内部融合对于相应 ABE 活性的影响。

结果证实，通过 DS1249 位点融合、结合 ecTadA（VN）所得到的 ABE 变体，表现出特别高的 A>G 活性，突变率超过 80%；并表现出明显的 C>T 活性，突变率接近 30%。

这也让课题组更有信心开启新的课题。在自然界的原核生物中，几乎都有 TadA 同源蛋白存在，其数量高达几千种之多。作为新成立的实验室，程田林团队无法对多达上千种的 TadA 同源蛋白进行高通量筛选，否则单 TadA 蛋白合成的成本可能高达数十万元。

此外，尽管通过内部融合来结合双点突变，可以让大肠杆菌来源的 ecTadA 构建出高活性的 ABE。但是，这一策略是否适合于其它物种来源的 TadA，依旧是一个未知数。

如何从上千种蛋白中挑选出有代表性的 TadA 同源蛋白？该团队的策略是通过进化树分析的方法，来对 TadA 同源蛋白进行分类。

然后，根据进化距离和序列的相似度，挑选出进化距离较远、且序列相似度较低的蛋白，以尽可能覆盖所有可能的 TadA 同源蛋白类型，从而检测其用于构建碱基编辑器的可行性，并探索构建差异化碱基编辑器的可能。

最终，他们挑选出 54 种 TadA 同源蛋白，通过 DS1249 内部融合，以及对应于 ecTadA 蛋白的 A106V 和 D108N 的单/双点突变，对构建碱基编辑器进行了功能验证。

结果发现，除David Liu 团队报道的大肠杆菌 ecTadA 之外，至少还有 24 种 TadA 同源蛋白，可以通过 N 或 VN 突变进行工程化改造，从而生成功能性碱基编辑器。

在这些 TadA 同源蛋白里，8 种主要表现为 ABE 活性，9 种具有明显的 ABE 和 CBE 的活性，7 种主要表现为 CBE 活性。

程田林说：“这一结果让人非常意外，我们没想到会有多达 7 种 TadA 同源蛋白通过简单的双点突变改造，就能直接构建高活性的 CBE 工具。”

同时，结合已有的关于 TadA 家族蛋白与 AID/APOBEC 家族蛋白的演化关系，这一研究也为 AID/APOBEC 可能起源于 TadA 这一假说提供了相当扎实的证据。

事实上，考虑到 ABE“开山之作”中 ecTadA 改造的困难程度，针对 TadA 同源蛋白进行筛选和改造的做法，课题组一直有所畏惧。

他们曾尝试将 ecTadA 突变体中的 10 多个点突变，“移植”到其它物种的 TadA 同源蛋白中。然而，这 10 多个点突变对应的氨基酸位点，在其它物种中并不是完全保守的。因此，在 TadA 同源蛋白中，单纯地对保守位点进行点突变“移植”的尝试并未获得成功。

但是，在对点突变位点的保守性进行分析时，他们注意到 A106 和 D108 两个位点，在 TadA 同源蛋白中呈现出高度保守性。并且，在 ecTadA 蛋白定向演化的第一轮中，A106V 和 D108N 已经是高度富集的点突变。

基于此，在合成 TadA 同源蛋白时，课题组直接将对应于 A106 和 D108 的氨基酸突变为 V 和 N。然后，通过 DS1249 的内部融合，来对构建 ABE 进行功能筛选。

事实上，他们原本的计划是：在 A106V 和 D108N 的基础上，逐一增加其它点突变，以便在 TadA 同源蛋白中，寻找具有普适性的点突变组合。

而令人欣喜的是，只需 A106V 和 D108N 的双点突变，就足以让 24/54 种 TadA 同源蛋白构建出功能性的碱基编辑器，并且涵盖 ABE、CBE 和 ACBE 三种类型。至此，本次课题告一段落，实验室成员开始论文写作。

近日，相关论文以《TadA 直系同源物可以对碱基编辑器进行胞嘧啶和腺嘌呤编辑》（TadA orthologs enable both cytosine and adenine editing of base editors）为题发在 Nature Communications 上。

图 | 相关论文（来源：Nature Communications）

程田林实验室的张淑倩博士、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心袁博博士是共同一作，程田林担任通讯作者。

复旦大学类脑智能科学与技术研究院赵兴明实验室、以及上海交通大学医学院松江研究院仇子龙实验室，也给予了大力支持和帮助。

接下来，程田林的设想是：

一是利用新设计的筛选方案继续发掘更多脱氨基酶以及其它类型的 DNA 修饰酶，以构建更具特色的碱基编辑器；二是对现有 20 多种不同物种来源的 TadA 同源蛋白，进行后续的蛋白质工程改造，以及对衍生碱基编辑器的编辑特性进行优化，并探索差异化碱基编辑器构建的可行性，以期为基因治疗奠定更多基础。

参考资料：

1.Zhang, S., Yuan, B., Cao, J. et al. TadA orthologs enable both cytosine and adenine editing of base editors. Nat Commun 14, 414 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36003-3